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Kit di rilevazione Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR per 2019-nCoV
Usu previstu
Stu kit hè adupratu per a rilevazione qualitativa di u novu coronavirus (2019-nCoV) aduprendu tamponi di gola, tamponi nasofaringei, fluidu di lavaggio broncoalveolare, sputu. U risultatu di a rilevazione di stu pruduttu hè solu per riferimentu clinicu, è ùn deve esse adupratu cum'è unica prova per a diagnosi clinica è u trattamentu. Un'analisi cumpleta di a cundizione hè cunsigliata in cumbinazione cù e manifestazioni cliniche di u paziente è altri testi di laburatoriu.
Principiu d'ispezione
U kit hè basatu annantu à a tecnulugia RT-PCR in un passu. In fatti, i geni ORF1ab è N di u novu coronavirus 2019 (2019-nCoV) sò stati selezziunati cum'è regioni bersagliu di l'amplificazione. Primer specifichi è sonde fluorescenti (e sonde di u gene N sò marcate cù FAM è e sonde ORF1ab sò marcate cù HEX) sò cuncepiti per rilevà l'ARN di u novu tipu di coronavirus 2019 in i campioni. U kit include ancu un sistema di rilevazione di cuntrollu internu endogenu (sonda di u gene di cuntrollu internu marcata cù CY5) per monitorà u prucessu di raccolta di campioni, amplificazione di l'ARN è di a PCR, riducendu cusì i risultati falsi negativi.
Cumponenti principali
| Cumponenti | Volume(48T/Kit) |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Cuntrollu negativu | 1500µl |
| nCOV cuntrolu pusitivu (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Reagenti propri: Reagenti d'estrazione o di purificazione di l'ARN. Cuntrollu negativu/positivu: U cuntrollu pusitivu hè l'ARN chì cuntene u frammentu bersagliu, mentre chì u cuntrollu negativu hè acqua senza acidi nucleichi. Durante l'usu, devenu participà à l'estrazione è devenu esse cunsiderati infettivi. Devenu esse manipulati è smaltiti in cunfurmità cù e regulazioni pertinenti.
U genu di riferimentu internu hè u genu RnaseP umanu.
Cundizioni di conservazione è data di scadenza
-20 ± 5 ℃, evitate a congelazione è u scongelamentu ripetuti più di 5 volte, validu per 6 mesi.
Strumentu applicabile
Cù FAM / HEX / CY5 è altri strumenti PCR fluorescenti multicanale.
Requisiti di campione
1. Tipi di campioni applicabili: tamponi di gola, tamponi nasofaringei, fluidu di lavaggio broncoalveolare, sputo.
2. Raccolta di campioni (tecnica asettica)
Tampone faringeu: Asciugate e tonsille è a parete faringea posteriore cù dui tamponi à u listessu tempu, poi immergete a testa di u tampone in una provetta chì cuntene a suluzione di campionamentu.
Sputu: Dopu chì u paziente hà una tosse prufonda, raccoglie u sputu tossitu in una provetta cù tappu à vite chì cuntene a suluzione di campionamentu; fluidu di lavaggio broncoalveolare: Campionamentu da prufessiunali medichi. 3. Conservazione è trasportu di campioni
I campioni per l'isolamentu di u virus è i testi di l'ARN devenu esse testati u più prestu pussibule. I campioni chì ponu esse rilevati in 24 ore ponu esse cunservati à 4 ℃; quelli chì ùn ponu esse rilevati in 24
ore devenu esse almacenati à -70 ℃ o sottu (s'ellu ùn ci hè micca una cundizione di almacenamentu di -70 ℃, devenu esse
(cunservatu temporaneamente à -20 ℃ in frigorifero). I campioni devenu evità a congelazione è u scongelamentu ripetuti durante u trasportu. I campioni devenu esse mandati à u laburatoriu u più prestu pussibule dopu a raccolta. Se i campioni devenu esse trasportati nantu à longhe distanze, si raccomanda a conservazione in ghiaccio secco.
Metodi di prova
1 Trasfurmazione di campioni è estrazione di ARN (zona di trasfurmazione di campioni)
Hè cunsigliatu di piglià 200 μl di campione liquidu per l'estrazione di l'ARN. Per i passi d'estrazione cunnessi, riferitevi à l'istruzzioni di i kit d'estrazione di l'ARN cummerciali. Sia u negativu sia u negativu
I cuntrolli in questu kit sò stati implicati in l'estrazione.
2 Preparazione di reagenti PCR (zona di preparazione di reagenti)
2.1 Eliminate tutti i cumpunenti da u kit è scongelate è mischiate à temperatura ambiente. Centrifugate à 8.000 rpm per uni pochi secondi prima di l'usu; calculate a quantità necessaria di reagenti, è u sistema di reazione hè preparatu cum'è mostratu in a seguente tabella:
| Cumponenti | Porzione N (sistema da 25 µl) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 µl × N |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = numeru di campioni testati + 1 (cuntrollu negativu) + 1 (nCOV)cuntrollu pusitivu) | |
2.2 Dopu avè mischiatu bè i cumpunenti, centrifugà per un cortu periodu per lascià chì tuttu u liquidu nantu à a parete di u tubu caschi in u fondu di u tubu, è dopu aliquotà u sistema di amplificazione di 20 µl in u tubu PCR.
3 Campionamentu (zona di preparazione di campioni)
Aghjunghjite 5 μl di i cuntrolli negativi è pusitivi dopu l'estrazione. L'ARN di u campione da testà hè aghjuntu à u tubu di reazione PCR.
Chiudete bè u tubu è centrifugate à 8.000 giri/min per uni pochi secondi prima di trasferiscelu in a zona di rilevazione di l'amplificazione.
4 Amplificazione PCR (zona di rilevazione amplificata)
4.1 Pone u tubu di reazione in a cella di campione di u strumentu, è impostate i parametri cum'è seguita:
| scena | Ciclu numeru | Temperatura(°C) | Tempu | cullezzionesitu |
| Inversutrascrizione | 1 | 42 | 10 minuti | - |
| Pre-denaturazionen | 1 | 95 | 1 minutu | - |
| Ciclu | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | Anni 30 | cullezzione di dati |
Selezzione di u canale di rilevazione di u strumentu: Selezziunate u canale FAM, HEX, CY5 per u signale di fluorescenza. Per a fluorescenza di riferimentu NONE, ùn sceglite micca ROX.
5 Analisi di i risultati (Per piacè riferitevi à l'istruzzioni sperimentali di ogni strumentu per a impostazione)
Dopu à a reazione, salvate i risultati. Dopu à l'analisi, aghjustate u valore iniziale, u valore finale è u valore di soglia di a linea di basa secondu l'imagine (l'utente pò aghjustà secondu a situazione attuale, u valore iniziale pò esse impostu à 3 ~ 15, u valore finale pò esse impostu à 5 ~ 20, aghjustamentu) in u graficu logaritmicu. À a soglia di a finestra, a linea di soglia hè in a fase logaritmica, è a curva di amplificazione di u cuntrollu negativu hè una linea retta o sottu à a linea di soglia).
6 Cuntrollu di qualità (Un cuntrollu prucedurale hè inclusu in a prova) Cuntrollu negativu: Nisuna curva di amplificazione evidente per i canali di rilevazione FAM, HEX, CY5
Cuntrollu pusitivu COV: curva di amplificazione evidente di i canali di rilevazione FAM è HEX, valore Ct ≤32, ma nisuna curva di amplificazione di u canale CY5;
I requisiti sopra citati devenu esse soddisfatti simultaneamente in u listessu esperimentu; altrimenti, l'esperimentu ùn hè micca validu è deve esse ripetutu.
7 Determinazione di i risultati.
7.1 S'ellu ùn ci hè micca una curva d'amplificazione o un valore Ct > 40 in i canali FAM è HEX di u campione di prova, è ci hè una curva d'amplificazione in u canale CY5, si pò ghjudicà chì ùn ci hè micca RNA di u novu coronavirus 2019 (2019-nCoV) in u campione;
.2 Sè u campione di prova hà curve di amplificazione evidenti in i canali FAM è HEX, è u valore Ct hè ≤40, si pò ghjudicà chì u campione hè pusitivu per u novu coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Sè u campione di prova hà una curva di amplificazione chjara solu in un canale di FAM o HEX, è u valore Ct hè ≤40, è ùn ci hè micca curva di amplificazione in l'altru canale, i risultati devenu esse testati di novu. Sè i risultati di u novu test sò coerenti, u campione pò esse ghjudicatu pusitivu per u novu
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Sè u risultatu di u novu test hè negativu, si pò ghjudicà chì u campione hè negativu per u novu coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valore di ghjudiziu pusitivu
U metudu di a curva ROC hè adupratu per determinà u valore di riferimentu CT di u kit è u valore di riferimentu di cuntrollu internu hè 40.
Interpretazione di i risultati di e prove
1. Ogni esperimentu deve esse testatu per cuntrolli negativi è pusitivi. I risultati di i testi ponu esse determinati solu quandu i cuntrolli rispondenu à i requisiti di cuntrollu di qualità.
2. Quandu i canali di rilevazione FAM è HEX sò pusitivi, u risultatu di u canale CY5 (canale di cuntrollu internu) pò esse negativu per via di a cumpetizione di u sistema.
3. Quandu u risultatu di u cuntrollu internu hè negativu, se i canali di rilevazione FAM è HEX di a provetta sò ancu negativi, significa chì u sistema hè disattivatu o chì l'operazione hè sbagliata, a prova ùn hè micca valida. Dunque, i campioni devenu esse testati di novu.
