I prudutti
Kit di rilevazione Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR per 2019-nCoV
Usu previstu
Stu kit hè utilizatu per a rilevazione qualitativa di u novu coronavirus (2019-nCoV) cù tamponi di gola, tamponi nasofaringei, fluidi di lavaggio broncoalveolare, sputo. evidenza per u diagnosticu clinicu è u trattamentu. Un analisi cumpletu di a cundizione hè cunsigliatu in cumminazione cù e manifestazioni cliniche di u paziente è altre teste di laboratori.
Principiu d'ispezione
U kit hè basatu annantu à a tecnulugia RT-PCR in un passu.In fatti, u novu coronavirus 2019 (2019-nCoV) ORF1ab è geni N sò stati scelti cum'è e regioni di destinazione di amplificazione.I primers specifici è e sonde fluorescenti (le sonde geniche N sò marcate cù FAM è e sonde ORF1ab sò marcate cù HEX) sò pensati per detectà l'RNA di coronavirus di novu tipu 2019 in campioni.U kit include ancu un sistema di rilevazione di cuntrollu internu endogenu (sonda di gene di cuntrollu internu marcata cù CY5) per monitorizà u prucessu di raccolta di campioni, amplificazione di RNA è PCR, riducendu cusì risultati falsi negativi.
Cumpunenti principali
| Cumpunenti | Volume（48T/Kit） |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864 µl |
| U cuntrollu negativu | 1500 µl |
| nCOV cuntrolu pusitivu (l ORF1ab N Gene) | 1500 µl |
Reagenti propri: reagenti di estrazione o purificazione di RNA.Cuntrolu negativu / pusitivu: U cuntrollu pusitivu hè RNA chì cuntene u fragmentu di destinazione, mentri u cuntrollu negativu hè acqua senza acidu nucleicu.Durante l'usu, anu da participà à l'estrazione è deve esse cunsideratu infizziosi.Deve esse trattatu è eliminati in cunfurmità cù i regulamenti pertinenti.
U genu di riferimentu internu hè u genu RnaseP umanu.
Cundizioni di almacenamiento è data di scadenza
-20±5 ℃, evite u congelamentu ripetutu è u scongelu più di 5 volte, validu per 6 mesi.
Strumentu applicabile
Cù FAM / HEX / CY5 è altri strumenti di PCR fluorescenti multicanale.
Esigenze di specimen
1. Tipi di campioni applicabili: tamponi di gola, tamponi nasofaringei, liquido di lavaggio broncoalveolare, sputum.
2. Raccolta di campioni (tecnica aseptica)
Tamponamentu faringeu: Pulisce e tonsille è u muru faringeu posteriore cù dui tamponi à u stessu tempu, dopu immerse a testa di tampone in un provettu chì cuntene a suluzione di campionamentu.
Sputum: Dopu chì u paci hà una tossa prufonda, cullighjate l'sputum tossu in un tubu di teste di tappa di vite chì cuntene a suluzione di mostra;Fluido di lavaggio bronchoalveolare: Campionamentu da i prufessiunali medichi.3.Storage è trasportu di mostri
I campioni per l'isolamentu di virus è a prova di RNA devenu esse pruvati u più prestu pussibule.I campioni chì ponu esse rilevati in 24 ore ponu esse guardati à 4 ℃;quelli chì ùn ponu esse rilevati in 24
l'ore deve esse guardatu à -70 ℃ o sottu (se ùn ci hè micca una cundizione di almacenamento di -70 ℃, deve esse
conservatu temporaneamente in un frigorifero -20 ℃).I campioni anu da evità a congelazione ripetuta è u scongelu durante u trasportu.Specimens deve esse mandatu à u laboratoriu u più prestu pussibule dopu a cullizzioni.Se i campioni anu da esse trasportati à longu distanzi, u almacenamentu di ghiaccio seccu hè cunsigliatu.
I metudi di prova
1 Trattamentu di campioni è estrazione di RNA (area di trasfurmazioni di campioni)
Hè cunsigliatu di piglià 200μl di mostra liquidu per l'estrazione di RNA.Per i passi di estrazione in relazione, riferite à l'istruzzioni di i kit di estrazione di RNA cummerciale.Sia u negativu è negativu
i cuntrolli in questu kit sò stati implicati in l'estrazione.
2 Preparazione di reagenti PCR (zona di preparazione di reagenti)
2.1 Elimina tutti i cumpunenti da u kit è scongelu è mischjà à a temperatura di l'ambienti.Centrifuga à 8 000 rpm per uni pochi di sicondi prima di l'usu;calculate a quantità necessaria di reagenti, è u sistema di reazione hè preparatu cum'è mostra in a tabella seguente:
| Cumpunenti | N porzione (sistema 25 µl) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 µl × N |
| Soluzione di reazione RT-PCR | 2 µl × N |
| * N = numeru di campioni testati + 1 (cuntrollu negativu) + 1 (nCOVcuntrollu pusitivu) | |
2.2 Dopu à mischjà bè i cumpunenti, centrifuga per un pocu tempu per lascià tuttu u liquidu nantu à u muru di u tubu cascà à u fondu di u tubu, è poi aliquot u sistema di amplificazione 20 µl in u tubu PCR.
3 Campioni (zona di preparazione di l'esemplari)
Aghjunghjite 5μl di i cuntrolli negativi è pusitivi dopu l'estrazione.L'RNA di a mostra per esse pruvatu hè aghjuntu à u tubu di reazione PCR.
Tappa u tubu strettu è centrifuga à 8.000 rpm per uni pochi di sicondi prima di trasferisce à l'area di rilevazione di amplificazione.
4 Amplificazione PCR (area di rilevazione amplificata)
4.1 Pone u tubu di reazione in a cellula di mostra di l'instrumentu, è stabilisce i paràmetri cum'è seguente:
| stage | Ciclu numeru | Temperature(°C) | U tempu | cullizzionisitu |
| Inversutrascrizzione | 1 | 42 | 10 min | - |
| Pre-denaturazionen | 1 | 95 | 1 min | - |
| Ciclu | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | raccolta di dati |
Selezzione di u canale di rilevazione di l'instrumentu: Selezziunate u canali FAM, HEX, CY5 per u signale di fluorescenza.Per riferimentu fluorescente NONE, per piacè ùn sceglite micca ROX.
5 Analisi di u risultatu (Per piacè riferite à l'istruzzioni sperimentali di ogni strumentu per a paràmetrazione)
Dopu à a reazione, salvà i risultati.Dopu l'analisi, aghjustate u valore iniziale, u valore finale è u valore di soglia di a linea di basa secondu l'imaghjini (l'utilizatore pò aghjustà secondu a situazione attuale, u valore iniziale pò esse stabilitu à 3 ~ 15, u valore finale pò esse stabilitu à 3 ~ 15). 5 ~ 20, aghjustamentu) in u gràficu logaritmicu À u limitu di a finestra, a linea di limitu hè in a fase logaritmica, è a curva di amplificazione di u cuntrollu negativu hè una linea recta o sottu à a linea di limitu).
6 Controlu Quauty (Un cuntrollu procedurale hè inclusu in a prova) Control negativu: Nisuna curva di amplificazione evidenti per i canali di rilevazione FAM, HEX, CY5 n
Cuntrolu pusitivu COV: curva di amplificazione evidenti di i canali di rilevazione FAM è HEX, valore Ct≤32, ma senza curva di amplificazione di u canali CY5;
I requisiti di sopra deve esse cumpletu simultaneamente in u stessu esperimentu;altrimenti, l'esperimentu ùn hè micca validu è deve esse ripetutu.
7 Determinazione di i risultati.
7.1 Se ùn ci hè micca una curva di amplificazione o un valore Ct> 40 in i canali FAM è HEX di u campione di prova, è ci hè una curva di amplificazione in u canali CY5, pò esse ghjudicatu chì ùn ci hè micca un novu coronavirus 2019 (2019-nCoV) RNA in a mostra;
.2 Se a mostra di prova hà curve di amplificazione evidenti in i canali FAM è HEX, è u valore Ct hè ≤40, pò esse ghjudicatu chì a mostra hè pusitiva per u novu coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Se a mostra di prova hà una curva di amplificazione chjara solu in un canale di FAM o HEX, è u valore Ct hè ≤40, è ùn ci hè micca una curva di amplificazione in l'altru canale, i risultati anu da esse testatu.Se i risultati di retest sò cunsistenti, a mostra pò esse ghjudicata pusitiva per u novu
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Se u risultatu di retest hè negativu, pò esse ghjudicatu chì a mostra hè negativa per u novu coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valore di ghjudiziu pusitivu
U metudu di a curva ROC hè utilizatu per determinà u valore di riferimentu CT di u kit è u valore di riferimentu di cuntrollu internu hè 40.
Interpretazione di i risultati di a prova
1.Ogni esperimentu deve esse pruvatu per cuntrolli negativi è pusitivi.I risultati di a prova ponu esse determinati solu quandu i cuntrolli rispondenu à i requisiti di cuntrollu di qualità
2.Quandu i canali di deteczione FAM è HEX sò pusitivi, u risultatu da u canali CY5 (canale di cuntrollu internu) pò esse negativu per via di a cumpetizione di u sistema.
3.Quandu u risultatu di u cuntrollu internu hè negativu, se i canali di rilevazione FAM è HEX di u tubu di teste sò ancu negativi, significa chì u sistema hè disattivatu o l'operazione hè sbagliata, a prova hè invalida.Per quessa, i campioni anu da esse testatu novu.
